如何選擇合適的宿主菌：

1、所選的宿主菌株應(yīng)對(duì)所用質(zhì)粒的抗生素抗性基因敏感。

2、如進(jìn)行藍(lán)/白斑篩選，宿主菌β-半乳糖苷酶的α-肽編碼區(qū)應(yīng)在染色體或附加體上缺失掉( lac Z Δ Μ15)。*0和DH5α

都能用于藍(lán)/白斑篩選。

3、要表達(dá)重組蛋白，可使用帶有可誘導(dǎo)的T7 RNA聚合酶基因的菌株，如BL21(DE3)和BL21(DE3)pLysS。

4、使用pGEM載體克隆大片段時(shí)(>7-8 kb)，經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株在30℃而不是在37℃生長(zhǎng)，更有利于復(fù)蘇。作簡(jiǎn)單的亞克隆連接實(shí)驗(yàn)，亞克隆轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞就可滿足克隆需要，更高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞可用于作比較困難的克隆實(shí)驗(yàn)。為提高獲得目的克隆的機(jī)會(huì)，應(yīng)用盡可能高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞(>10 8 cfu/μg DNA)。

如何篩選重組菌落：

1、可使用藍(lán)/白斑篩選法，在涂布有IPTG和X-Gal的篩選平板上，重組菌株為白色，未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的菌株為藍(lán)色。

2、可對(duì)小量提取的質(zhì)粒DNA做限制性酶切，采用Solarbio公司的質(zhì)粒提取試劑盒，可快速提取多個(gè)樣本，而且由于提取的質(zhì)粒純度高，不會(huì)有酶切切不開影響實(shí)驗(yàn)的情況。

3、也可直接用細(xì)菌菌落進(jìn)行PCR反應(yīng)，篩選存在目的片段的重組菌落。Solarbio公司生產(chǎn)的PCR反應(yīng)系統(tǒng)(MasterMix系列產(chǎn)品)特別適合這種方法。用滅菌的吸頭挑取單個(gè)菌落到已加入MasterMix的PCR管中，加入特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)前在94℃變性5分鐘，有利于細(xì)菌的裂解，提高PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的成功率。將所得PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上檢測(cè)擴(kuò)增帶。

4、另一種篩選重組菌落的方法是用插入片段特異引物進(jìn)行菌落雜交。菌落生長(zhǎng)后轉(zhuǎn)移到固體支持物如硝酸纖維膜上，作原位裂解，使質(zhì)粒附著到膜上，然后用核酸引物作雜交。多用于篩選稀有克隆菌落。

如何檢測(cè)感受態(tài)細(xì)胞的效價(jià)：

為確定感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，可將一定量的超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，取一部分轉(zhuǎn)化的細(xì)菌，涂布到選擇培養(yǎng)基上，可用菌落生長(zhǎng)單位/μg DNA，按下面的方法計(jì)算感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率。

計(jì)算公式：轉(zhuǎn)化效率＝產(chǎn)生菌落的總數(shù)/鋪板DNA的總量

例如：取1μl(0.1 ng/μl)超螺旋質(zhì)粒轉(zhuǎn)化100μl的感受態(tài)細(xì)胞。

向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中加入900μl培養(yǎng)液，讓細(xì)菌恢復(fù)一小段時(shí)間，取100μl鋪板，培養(yǎng)，產(chǎn)生1000個(gè)菌落。

轉(zhuǎn)化0.1 ng DNA，用SOC稀釋到1000μl后，取1/10涂平板，則涂平板共用0.01 ng質(zhì)粒DNA，所以轉(zhuǎn)化率＝1000克隆/0.01 ng DNA

=10 5 cfu/ng=10 8 cfu/μg。

轉(zhuǎn)化效率1×10 6 cfu/μg DNA可滿足普通的亞克隆實(shí)驗(yàn)；1×10 7cfu/μg DNA用于作更復(fù)雜的亞克隆，有*的DNA的轉(zhuǎn)化，T-克隆實(shí)驗(yàn)；構(gòu)建文庫和突變要求用的轉(zhuǎn)化的效率為>1×10 8 cfu/μg DNA。