一、 HRP 辣根過氧化酶是常見的酶促發(fā)光或顯色的交聯(lián)酶，由于HRP比活高、特異性更強、分子量?。?0kD）、穩(wěn)定性好和作用底物范圍廣的優(yōu)點而得到廣泛使用。HRP的底物種類有不少，主要可以分為化學(xué)發(fā)光底物和生色底物2大類:

1. 化學(xué)發(fā)光底物：

化學(xué)發(fā)光底物主要考慮的是：發(fā)光信號強弱——發(fā)光信號當(dāng)然越強越好，強發(fā)光信號持續(xù)的時間也是越長越好，還有就是背景低靈敏度高。

原理：試劑中的發(fā)光物在辣根過氧化物酶的作用下發(fā)生氧化降解，并發(fā)射波長為428nm的光，此光可經(jīng)x光膠片(放射自顯影片)感光記錄下來。

常用的化學(xué)發(fā)光底物有ECL，在ECL底物中，含有H2O2和魯米諾，在HRP的作用下，發(fā)出熒光來。

索萊寶ECL Plus

產(chǎn)品簡介:索萊寶ECL Plus熒光檢測試劑采用*的發(fā)光底物系統(tǒng)，具有靈敏度和高信噪比，可檢測出10-100 fg的微量抗原，檢測靈敏度高出普通ECL產(chǎn)品100倍以上；同時該試劑極其節(jié)省抗體(一抗1:2000-1:6000，二抗1:4000-1:10000)，產(chǎn)生的非特異背景非常低。發(fā)光迅速，熒光可使X感光膠片感光達(dá)12小時以上，特別適用于痕量蛋白或核酸檢測。

產(chǎn)品組成：以100ml規(guī)格為例，含50 ml 溶液A和50 ml 溶液B。根據(jù)用量，使用前混合。用途：用于HRP標(biāo)記抗體的Western Blot和HRP標(biāo)記探針的核酸雜交。

安全性：無特殊毒性，按普通化學(xué)品處理。

產(chǎn)品儲存：4 ºC避光儲存1年。25 ºC室溫放置數(shù)周不影響質(zhì)量。

同時索萊寶還擁有多種ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，更大程度的方便了客戶的實驗過程。

索萊寶ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒

產(chǎn)品內(nèi)容：
1. 封閉試劑： 30g(可配制 400ml)。
2. 10 倍濃縮抗體稀釋液50ml。
3. HRP 標(biāo)記二抗0.3ml，效價 1： 500-1000。
4. ECL 顯色液，25mlA+25mlB。
產(chǎn)品保存：-20℃避光密閉保存，一年有效。若經(jīng)常使用，可將封閉試劑，抗體稀釋液和 ECL 顯色液存放于 2-8℃以方便使用。

HRP的生色底物顯色有DAB， AEC和TMB等（而得到可溶性產(chǎn)物的底物如OPD，ABTS等則適用于ELISA）中，與化學(xué)發(fā)光法中的酶促基團發(fā)光不同，底物顯色主要是利用底物在有HRP和過氧化氫的存在下失去電子而呈現(xiàn)出顏色變化積累，這一過程檢測WB的結(jié)果。

HRP的催化反應(yīng)需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應(yīng)的過程如下:
HRP
DH2＋H2O2────→D＋2H2O
供氫體的種類很多，形成的產(chǎn)物特點不一。

• DAB(3.3－二氨基聯(lián)苯胺)的反應(yīng)產(chǎn)物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。DAB可以和HRP作用形成褐色不溶性產(chǎn)物，靈敏度高，特異性好，缺點就是需要現(xiàn)配現(xiàn)用，顯色后光照數(shù)小時會褪色，不能*保存，需要拍照記錄，而且有毒。

•  

• 目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯(lián)苯胺)。前者形成的產(chǎn)物為深桔黃色或棕色，后者產(chǎn)物為藍(lán)綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩(wěn)定，空白可近于無色。

?

TMB雙組分是將A、B液分開放置，現(xiàn)用現(xiàn)混；TMB單組分則將A、B液預(yù)先混合在一起，直接使用。其TMB雙組分顯色液有50*2、100*2、250*2、500*2四個規(guī)格，可根據(jù)不同實驗的需求選擇不同規(guī)格產(chǎn)品。

• 另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2'-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應(yīng)產(chǎn)物呈藍(lán)綠色，且靈敏度和穩(wěn)定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB因致癌可能性較小，因此皆是值得被優(yōu)選的供氫體。

?

堿性磷酸酶AP：

Western Blot檢測系統(tǒng)中常用交聯(lián)酶兩大家族中的另外一類就是AP——堿性磷酸酶。由于AP實驗經(jīng)常會遇到膜上顯色背景偏高的問題，所以就WesternBlot本身來說偏愛HRP的要比AP多。AP顯色底物生成的產(chǎn)物主要是藍(lán)紫色，成像性好，容易拍照。早些年前，AP檢測的靈敏度比HRP高，整個顯色過程更有“技術(shù)性”，有許多個人技巧在里面，讓人取舍兩難。如今由于HRP的化學(xué)發(fā)光底物已經(jīng)不斷改進(jìn)而使得靈敏度不斷提高，化學(xué)發(fā)光顯色上HRP和AP不相上下，但是生色反應(yīng)來說，AP顯色的靈敏度還是比一般的HRP顯色底物要高。

AP常用的檢測底物常用的是BCIP ，NBT 和INT。為了達(dá)到更好的效果我們經(jīng)常會將其結(jié)合使用

?