谷*甘肽過氧化物酶（GSH-Px/GPX）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC1195

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑一：臨用前取一瓶加入1.65mL蒸餾水溶解，2-8℃可保存2周；

2、 試劑一工作液：臨用前根據(jù)樣本數(shù)量按照試劑一：稀釋液=1:1的比例進行配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；

3、 試劑二工作液：臨用前按2 μL試劑二：10 mL蒸餾水的比例稀釋試劑二，現(xiàn)用現(xiàn)配；

4、 試劑三：瓶底若有結(jié)晶可50℃水浴溶解，此溶液為飽和溶液，若底部最終還有結(jié)晶，吸取上清使用即可；

5、 試劑四：若試劑有析出可40℃加熱溶解，也可震蕩促進溶解；

6、 標(biāo)準品：10 mg還原型谷*甘肽。臨用前加入0.405 mL蒸餾水溶解為80 μmol/mL的標(biāo)準溶液備用，2-8℃可保存4周。

產(chǎn)品說明：

谷*甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px或GPX，EC.1.11.1.9）是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。GPX能夠催化還原型谷*甘肽（GSH）生成氧化型谷*甘肽（GSSG），使有毒的過氧化氫還原成無毒的羥基化合物。

GPX催化H₂O₂氧化GSH，產(chǎn)生GSSG，GSH能與DTNB生成在412nm處有特征吸收峰的化合物，412nm下吸光度的下降即可反應(yīng)GPX的活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計/酶標(biāo)儀、天平、臺式離心機、微量玻璃比色皿/96孔板、可調(diào)式移液槍、研缽/勻漿器/超聲破碎儀、EP管。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）  

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）:提取液體積(mL)為1:5~10的比例（建議稱取0.05 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿。5000 rpm，4℃離心10 min，取上清置冰上待測 (如上清不清澈可以離心更長時間)。

2、細菌、細胞：按照細胞數(shù)量10⁴個：提取液體積（mL）500~1000:1的比例（建議500萬細胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3s，間隔7s，總時間3 min）然后5000 rpm，4℃，離心10min，取上清置冰上待測 (如上清不清澈可以離心更長時間)。

3、血清（漿）等液體：直接測定。

二、測定步驟

1、 分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 將80 μmol/mL標(biāo)準液用蒸餾水稀釋為0.08 μmol/mL的標(biāo)準溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。（可取10μL 80 μmol/mL標(biāo)準液和990μL蒸餾水混合配成0.8μmol/mL的標(biāo)準溶液，再取100μL 0.8μmol/mL的標(biāo)準溶液和900μL蒸餾水混合配成0.08μmol/mL的標(biāo)準溶液）

3、 操作表：(在1.5 mL離心管中依次加入下列試劑)

充分混勻，4000 rpm常溫離心5 min，取上清于EP管或者96孔板中。

    充分混勻，室溫靜置15 min，測定412 nm下的吸光度，分別記為A測定管、A對照管、A標(biāo)準管、A空白管。計算ΔA測定=A對照管-A測定管，ΔA標(biāo)準=A標(biāo)準管-A空白管?？瞻坠芎蜆?biāo)準管僅需做1-2次。

三、GPX活性計算

1、 抑制百分率的計算

抑制百分率=(A對照管-A測定管) ÷（A對照管-A空白管）× 100%

盡量使樣本的抑制百分率在30-70%范圍內(nèi)，越靠近50%越準確。如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%，則通常需要調(diào)整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高，則需適當(dāng)稀釋樣本；如果測定出來的抑制百分率偏低，則需重新準備濃度比較高的待測樣本。

2、 GPX活性計算

（1）按蛋白濃度計算

活力單位定義：每mg蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化1 nmol GSH氧化定義為一個酶活力單位。

GPX (U/mg prot) =ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準÷C標(biāo)）×1000×V酶促÷（Cpr×V樣）÷T

=200×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷Cpr

（2）按樣本質(zhì)量計算

活力單位定義：每g樣本在反應(yīng)體系中每分鐘催化1 nmol GSH氧化定義為一個酶活力單位。

GPX (U/g 質(zhì)量)= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準÷C標(biāo)）×1000×V酶促÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=200×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷W

（3）按細胞數(shù)量計算

活力單位定義：每10⁴個細胞在反應(yīng)體系中每分鐘催化1 nmol GSH氧化定義為一個酶活力單位。

GPX (U/10⁴ cell)=ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準÷C標(biāo)）×1000×V酶促÷（細胞數(shù)量×V樣÷V樣總）÷T

=200×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活力單位定義：每mL液體在反應(yīng)體系中每分鐘催化1 nmol GSH氧化定義為一個酶活力單位。

GPX (U/mL)= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準÷C標(biāo)）×1000×V酶促÷V樣÷T=200×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準

C標(biāo)：標(biāo)準液混合物的濃度：0.08 μmol/mL；V酶促：酶促反應(yīng)體系體積，0.25 mL；V樣：酶促反應(yīng)中加入樣本體積，0.02 mL；V樣總：提取液體積，1 mL；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/mL；T：反應(yīng)時間，5 min；細胞數(shù)量：以萬計；W：樣本質(zhì)量，g；1000：換算系數(shù)，1 μmol=1000 nmol。

注意事項：

1、 吸光度若大于1.5時，建議將樣本用提取液稀釋后進行測定。

2、 建議一次不要做過多樣本以免檢測時間過長影響顯色，使測定不準確。

實驗實例：

1. 取0.1 g小鼠肝臟組織加入1 mL提取液進行勻漿研磨，取上清稀釋40倍后再按照測定步驟操作，用96孔板測得A測定管=0.152，A對照管=0.278，A標(biāo)準管=0.370，A空白管=0.064，計算?A測定=A對照管-A測定管=0.126，?A標(biāo)準=A標(biāo)準管-A空白管=0.306，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

GPX (U/g 質(zhì)量)=200×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷W×40（稀釋倍數(shù)）=32941 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.1 g楊樹葉片加入1 mL提取液進行勻漿研磨，用96孔板測得A測定管=0.199，A對照管=0.259，A標(biāo)準管=0.370，A空白管=0.064，計算?A測定=A對照管-A測定管=0.060，?A標(biāo)準=A標(biāo)準管-A空白管=0.306，按樣本質(zhì)量計算酶活得：

GPX (U/g 質(zhì)量)=200×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準÷W=392 U/g 質(zhì)量。

相關(guān)發(fā)表文獻：

[1] Yang Yang,Li Jing,Wei Cong,et al. Amelioration of nonalcoholic fatty liver disease by swertiamarin in fructose-fed mice. Phytomedicine. June 2019; 59.(IF4.18)

[2] Xuejuan Xia,Yuxiao,Xing,Guannan Li,et al. Antioxidant activity of whole grain Qingke (Tibetan Hordeum vulgare L) toward oxidative stress in d-galactose induced mouse model. Journal of Functional Foods. June 2018;(IF3.197)

[3] Qilong Wang, Guosheng Xiao, Guoliang Chen,et al. Toxic effect of microcystin-LR on blood vessel development. Toxicological & Environmental Chemistry. Feb 2019;(IF3.547)

[4] Wang H, Li Y Y, Qiu L Y, et al. Involvement of DJ1 in ischemic preconditioninginduced delayed

cardioprotection in vivo[J]. Molecular medicine reports,  2017, 15(2): 995-1001

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