NAD-蘋果酸脫氫酶（NAD-MDH）活性檢測試劑盒說明書
微量法
貨號(hào)：BC1045
規(guī)格：100T/96S
產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入360 μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存；

2. 試劑三：臨用前加入327 μL雙蒸水，用不完的試劑仍-20℃保存。

產(chǎn)品說明：
MDH（EC 1.1.1.37）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，線粒體中MDH是TCA循環(huán)的關(guān)鍵酶之一，催化蘋果酸形成草酰乙酸；相反，胞漿中MDH催化草酰乙酸形成蘋果酸。草酰乙酸是重要的中間產(chǎn)物，連接多條重要的代謝途徑。因此，MDH在細(xì)胞多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，包括線粒體的能量代謝、蘋果酸-天冬氨酸穿梭系統(tǒng)、活性氧代謝和抗病性等。根據(jù)不同的輔酶特異性，MDH分為NAD^-依賴的MDH和NADP^-依賴的MDH，細(xì)菌中通常只含有NAD-MDH，在真核細(xì)胞中，NAD-MDH分布于細(xì)胞質(zhì)和線粒體中。
NAD-MDH催化NADH還原草酰乙酸生成蘋果酸，導(dǎo)致340nm處光吸收下降。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/ 96孔板（UV板）、研缽/勻漿器、蒸餾水。

操作步驟：具體操作步驟詳見“產(chǎn)品資料"附件

注意事項(xiàng)：

1. 粗酶液的提取必須在0℃-4℃中操做完成，以防止酶變性失活。

2. 實(shí)驗(yàn)時(shí)，試劑二、試劑三和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

3. 使用光徑為1cm的微量石英比色皿時(shí)當(dāng)初始讀值小于0.7或者ΔA大于0.5時(shí)建議稀釋后測量。使用96孔UV板時(shí)當(dāng)初始讀值小于0.4或者ΔA大于0.3時(shí)建議稀釋后測量。

4. 建議一人加樣一人比色。因時(shí)間監(jiān)測范圍小，不推薦用96孔UV板同時(shí)測多個(gè)樣本。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.05g大鼠肝臟加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，使用微量石英比色皿測得計(jì)算ΔA測定管=A1測定-A2測定=0.8484-0.3068=0.5416，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.7628-0.7583=0.0045，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：NAD-MDH（U/g 質(zhì)量）=6431×(ΔA測定-ΔA空白) ÷W=6431×0.5371÷0.05=69082 U/g 質(zhì)量。

2. 取0.05g柳樹葉加入1mL提取液進(jìn)行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，使用微量石英比色皿測得計(jì)算ΔA測定管=A1測定-A2測定=0.7796-0.6917=0.0879，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.7628-0.7583=0.0045，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：NAD-MDH（U/g 質(zhì)量）=6431×(ΔA測定-ΔA空白) ÷W=6431×0.0834÷0.05=10727 U/g 質(zhì)量。

3. 取5μL血漿直接按照測定步驟操作，使用微量石英比色皿測得計(jì)算ΔA測定管=A1測定-A2測定=0.8194-0.7959=0.0235，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.7628-0.7583=0.0045，按血清/血漿體積計(jì)算酶活得：

NAD-MDH（U/mL）=6431×(ΔA測定-ΔA空白)=6431×0.019=122 U/mL。
參考文獻(xiàn)：

1. Yao Y X, Li M, Zhai H, et al. Isolation and characterization of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene reveal its function in malate synthesis[J]. Journal of plant physiology, 2011, 168(5): 474-480.

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