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專注于生物學試劑及試劑盒領域
服務熱線：18101056239
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產品型號：BC0455-100T/96S
更新時間：2024-04-15
廠商性質：生產廠家
訪 問 量 ：941
010-50973130
產品分類
貨號：BC0455
規(guī)格：100T/96S
產品內容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規(guī)格 | 保存條件 |
提取液 | 液體110 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體7.5 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體1mL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑六 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
試劑七 | 粉劑×2支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入6 mL蒸餾水，充分混勻。2-8℃可以保存4周。
2、 試劑四：臨用前取1支加入0.6 mL蒸餾水，充分混勻。分裝后-20℃保存，避免反復凍融，可以保存2周；
3、 試劑五：粉劑置于瓶內玻璃管中。臨用前加入10 mL蒸餾水，充分混勻。-20℃分裝保存，避免反復凍融，可以保存4周；
4、 試劑六：臨用前取1支加入1 mL蒸餾水，充分混勻（可做100T，為保證試劑盒使用時間，故多給一支）；可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃可以保存2周；臨用前按試劑六：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑六，現(xiàn)用現(xiàn)配；
5、 試劑七：臨用前取1支加入0.7 mL蒸餾水，充分混勻；可分裝后-20℃保存，避免反復凍融，-20℃可以保存2周；臨用前按試劑七：蒸餾水=1:1的比例稀釋試劑七，現(xiàn)用現(xiàn)配。
產品說明：
蔗糖磷酸化酶（Sucrose Phosphorylase, SP）(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，屬于糖基水解酶13家族，是一種催化轉移葡萄糖苷鍵的酶，能夠催化蔗糖和無機磷酸鹽合成1-磷酸-葡萄糖。該酶主要以蔗糖、1-磷酸葡萄糖為供體，多類物質如多羥基的糖和糖醇、酚羥基、羧基等為受體，催化合成各種糖苷。
SP能夠催化蔗糖產生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸變位酶催化下變位為6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下還原NADP+生成NADPH，導致340nm光吸收值增加。通過340nm吸光度的增加速率來反映SP活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、恒溫培養(yǎng)箱/水浴鍋、可調式移液器、研缽/勻漿器、微量石英比色皿/96孔UV板、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
1、組織：按照組織質量（g）︰提取液體積(mL)為1︰5-10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進行冰浴勻漿，然后10000g，4℃，離心10min ，取上清置于冰上待測。
2、細胞或細菌：先收集細胞或細菌到離心管內，離心后棄上清；按照細胞或細菌數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為500-1000︰1的比例（建議500萬個細胞或細菌加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細胞或細菌（功率200 W，超聲3秒，間隔7秒，總時間3 min）；然后10000 g，4℃，離心10 min ，取上清置于冰上待測。
3、液體：直接檢測。若液體渾濁可離心后取上清測定。
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計/酶標儀預熱30 min以上，調節(jié)波長至340 nm，分光光度計蒸餾水調零。
2、 試劑一37℃預熱10min。
3、 操作表：
空白管 | 測定管 | |
試劑一 | 85 | 65 |
試劑二 | 50 | 50 |
試劑三 | 5 | 5 |
試劑四 | 10 | 10 |
試劑五 | 10 | 10 |
試劑六 | 20 | 20 |
試劑七 | 20 | 20 |
混勻，37℃水浴預熱5min | ||
樣本（μL） | - | 20 |
迅速吹打混勻，記錄測定管第15s的吸光值A1測定（A1空白），迅速置于37℃水浴或培養(yǎng)箱2min（酶標儀有控溫功能可將溫度調至37℃），拿出迅速擦干測定2min15s時的吸光值A2測定（A2空白），計算ΔA =（A2測定-A1測定）-（A2空白-A1空白）。 空白管只需測定1-2次，如果樣本數(shù)量過多也可以將試劑一到試劑七按上述比例混勻后進行測定。 | ||
二、SP活性計算：
1、 用微量石英比色皿測定的計算公式：
(1) 按照蛋白濃度計算
酶活定義：37℃，每毫克蛋白質每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/mg prot）=ΔA÷ε÷d×V反總×109÷（V樣×Cpr）÷T = 803.85×ΔA÷Cpr
(2) 按照樣本質量計算
酶活定義：37℃，每克樣本每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/g 質量）=ΔA÷ε÷d×V反總×109÷(V樣÷V樣總×W)÷T= 803.85×ΔA÷W
(3) 按照細胞數(shù)量計算
酶活定義：37℃，每104個細胞每分鐘催化產生1nmol NADPH為一個酶活單位。
SP活性（U/104 cell）= ΔA÷ε÷d×V反總×10 9÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量（萬個）)÷T
= 803.85×ΔA÷細胞數(shù)量（萬個）
ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6220 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，0.0002L；V樣：反應體系中樣本體積，0.02mL；V樣總：提取液體積，1mL ；W：樣本質量，g；Cpr：蛋白濃度，mg/mL；T：反應時間，2min；109：1mol=109nmol。
2、 用96孔板測定的計算公式：
將上述公式中的d-1cm修改為d-0.6cm（96孔板光徑）進行計算即可。
注意事項：
1、如果測定吸光值A＞1，建議用提取液稀釋樣本后再測定，計算公式中乘以稀釋倍數(shù)；如果測定吸光值較低或接近空白OD值，建議增加樣本量后再進行測定。
實驗實例：
1、 稱取0.1 g土豆，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，10000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用微量石英比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA=（0.4070-0.3117）-（0.0956-0.0949）=0.0946。計算活性：
蔗糖磷酸化酶酶活（U/g 質量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10 9÷(V樣÷V樣總×W)÷T =760.44 U/ g質量
2、 稱取0.1 g黑米，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，10000 g，4℃條件下離心10 min；取上清置于冰上待測。使用微量石英比色皿按照測定步驟操作，計算ΔA =（0.4559-0.3546）-（0.0956-0.0949）=0.1006，計算活性：
蔗糖磷酸化酶酶活（U/g 質量）=ΔA÷ε÷d×V反總×10 9÷(V樣÷V樣總×W)÷T =808.67 U/ g質量
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