蘋果酸含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號(hào)：BC5495

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前加入5 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融，-20℃保存4周； 

2. 試劑四：臨用前按試劑四：試劑四稀釋液=10μL：1mL（約40T）的比例稀釋試劑四備用，現(xiàn)用現(xiàn)配，用多少配多少；

3. 標(biāo)準(zhǔn)品：100μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液。臨用前取10μL 100μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液，加入240μL蒸餾水，充分混勻，配制成4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液；再取100μL 4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液，加入900μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.4μmol/mL 蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)配現(xiàn)用。（實(shí)驗(yàn)中每管需要20μL，為減小實(shí)驗(yàn)誤差，故配制大體積）。                                                                                       

產(chǎn)品說明：

L-蘋果酸是三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，也是蘋果酸 - 天冬氨酸穿梭的重要組成部分。 蘋果酸-天冬氨酸穿梭是氧化磷酸化的還原當(dāng)量跨線粒體膜運(yùn)輸過程所必需的。在低等生物體內(nèi)，蘋果酸在蘋果乳酸發(fā)酵的過程中轉(zhuǎn)化為乳酸，同時(shí)產(chǎn)生CO₂。蘋果酸常用作食品和制藥工業(yè)的添加劑，蘋果酸的定量分析在啤酒、葡萄酒、奶酪和水果生產(chǎn)領(lǐng)域也具有至關(guān)重要的作用。

蘋果酸脫氫酶催化蘋果酸和NAD生成草酰乙酸、NADH和NH₄⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH 反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性Formazan，在450nm下有最大吸收峰，據(jù)此可計(jì)算蘋果酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：                                                                                                 

分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、水

浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水和冰。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁶個(gè)）：提取液一體積（mL）為5~10：1的比例（建議5百萬細(xì)胞加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，12000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會(huì)產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

二、測定步驟

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，波長調(diào)至450nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表：（按順序?qū)⑾铝性噭┘釉?/span>96孔板/1.5mL EP管中）

三、蘋果酸含量的計(jì)算

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

蘋果酸含量（μmol/mg prot）= ΔA測定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×V樣本÷（V樣本×Cpr）×F

= 0.4×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr×F

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

蘋果酸含量（μmol/g 質(zhì)量）= ΔA測定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)× (V上清+V提取液二) ÷ (W×V上清÷V提取液一) × F

= 0.475×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

蘋果酸含量（μmol/10⁶ cell）= ΔA測定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)× (V上清+V提取液二) ÷ (N×V上清÷V提取液一) ×F

= 0.475×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N×F

4. 按照液體體積計(jì)算

蘋果酸含量（μmol/mL）

= ΔA測定×C標(biāo)準(zhǔn)÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)× (V上清+V提取液二) ÷ [V液體×V上清÷ (V提取液一+V液體)] ×F

= 5.225×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)×F

C 標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.4μmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.02mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入提取液二的體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；N：細(xì)胞數(shù)量，10⁶個(gè)；V液體：液體樣本體積，0.1mL；F：稀釋倍數(shù)。

注意事項(xiàng)：

1. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取組織。

2. ΔA測定的測定范圍在0.01-1之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計(jì)算公式。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1. 取0.1075g香蕉果肉加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后用蒸餾水稀釋8倍后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計(jì)算，ΔA測定=A測定-A對照=0.581-0.098= 0.483，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.409-0.101=0.308，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

蘋果酸含量（μmol/g 質(zhì)量）= 0.475×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.475×0.483÷0.308÷0.1075×8=55.43 μmol/g質(zhì)量。

2. 取0.1033g鼠肝加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后按照測定步驟操作，使用96孔板測得計(jì)算，ΔA測定=A測定-A對照=0.271-0.118=0.153，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)-A空白=0.409-0.101=0.308，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

蘋果酸含量（μmol/g 質(zhì)量）= 0.475×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×F =0.475×0.153÷0.308÷0.1033×1=2.28 μmol/g質(zhì)量。

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