L-乳酸（L-LA）含量檢測試劑盒（WST顯色法）說明書

可見分光光度法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC5340

規(guī)格：50T/24S

產(chǎn)品組成：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 試劑二：臨用前按試劑二（V）：蒸餾水（V）=10μL：450μL（9T）的比例配制試劑二溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配；

2、 試劑三：臨用前加入8 mL 蒸餾水混勻，可分裝后-20℃保存4周，避免反復(fù)凍融；

3、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入1.04 mL蒸餾水配成100 μmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，2-8℃可保存12周；

產(chǎn)品說明：

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時(shí)使NAD⁺還原生成NADH和H⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可與NADH反應(yīng)，產(chǎn)生水溶性formazan，其在450nm處有最大吸收峰，據(jù)此可計(jì)算乳酸含量。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

分析天平、研缽/勻漿器/超聲波細(xì)胞破碎儀、離心機(jī)、可見分光光度計(jì)、1mL玻璃比色皿、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、蒸餾水。

操作步驟：

一、 樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

2. 細(xì)胞/細(xì)菌：按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞/細(xì)菌加入1mL提取液一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞/細(xì)菌（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃，12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

3. 血清（漿）等液體：取100μL液體加入1mL提取液一，4℃ 12000g離心10min，取0.8mL上清液，再緩慢加入0.15mL提取液二，緩慢吹打混勻至無氣泡產(chǎn)生，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

注：提取液二需緩慢加入，加入后會產(chǎn)生大量氣泡，建議使用2mL EP管進(jìn)行操作。

二、測定步驟

1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，波長調(diào)至450nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將100μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為0.625、0.3125、0.15625、0.078、0.039、0.020、0.01μmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

3、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋表：

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)管需50µL標(biāo)準(zhǔn)溶液

3、加樣表：（按順序?qū)⑾铝性噭┘釉?/span>EP管中）

三、乳酸含量的計(jì)算

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，以其對應(yīng)的吸光值（ΔA標(biāo)準(zhǔn)）為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程y=kx+b，將

ΔA測定帶入公式中得到x（μmol/mL）。

2、乳酸含量計(jì)算

（1）按照蛋白含量計(jì)算

L-LA含量（μmol/mg prot）=x×V樣本÷（V樣本×Cpr）=x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

L-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）=x×（V上清+V提取液二）÷（W×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷W

（3）按照細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量計(jì)算

L-LA含量（μmol/10⁴ cell）=x×（V上清+V提取液二）÷（N×V上清÷V提取液一）=1.1875×x÷N

（4）按照液體體積計(jì)算

L-LA含量（μmol/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液體×V上清÷（V提取液一+V液體）]=13.0625×x

V樣本：加入的樣本體積，0.05mL；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，蛋白濃度需自行測定；V上清：提取時(shí)上清液體積，0.8mL；V提取液二：加入的提取液二體積，0.15mL；V提取液一：加入的提取液一體積，1mL；N：細(xì)胞/細(xì)菌數(shù)量，10⁴個(gè)；V液體：液體樣本體積，0.1mL。

注意事項(xiàng)：

1. ΔA測定的測定范圍在0.01-1之間。如果測定吸光值超過線性范圍吸光值，可以用蒸餾水稀釋樣本后再次測定，如果測定吸光值小于線性范圍吸光值，需要增加樣本量后再次測定，注意同步計(jì)算公式。

2. 提取液一中含有蛋白質(zhì)沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。如需測定蛋白含量，需另取樣本。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1466g小鼠肝加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清后用蒸餾水稀釋兩倍，按照測定步驟操作，使用1mL比色皿測得計(jì)算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.972-0.092= 0.880，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.365x-0.0041，R²=0.9999，計(jì)算x=0.6477，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

L-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）= 1.1875×x÷W×稀釋倍數(shù)（2）=10.493 μmol/g質(zhì)量。

2、 取0.1063g紅薯根加入1mL提取液一，冰浴勻漿后離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用1mL比色皿測得計(jì)算ΔΔA測定=A測定管-A對照管=0.124-0.099=0.025，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.365x-0.0041，R²=0.9999，計(jì)算x=0.0213，按樣本質(zhì)量計(jì)算含量得：

L-LA含量（μmol/g 質(zhì)量）=1.1875×x÷W=0.2382μmol/g質(zhì)量。

3、 取100μL羊血清加入1mL提取液一，離心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，離心取上清，之后按照測定步驟操作，使用1mL比色皿測得計(jì)算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.587-0.095=0.492，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y=1.365x-0.0041，R²=0.9999，計(jì)算x=0.3634，按照液體體積計(jì)算含量得：

L-LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=4.748 μmol/mL。

參考文獻(xiàn)：

Eolbergrová J, MacMillan V, Siesj? B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD⁺ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.

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