單胺氧化酶（MAO）活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動，請注意并嚴格按照該說明書操作。

貨號：BC0015

規(guī)格：100T/96S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時聯(lián)系索萊寶工作人員。

產(chǎn)品說明：

MAO（EC1.4.3.4）包括MAO-A和MAO-B，是一種結(jié)合在線粒體外膜上的黃素蛋白，可催化神經(jīng)遞質(zhì)和生物胺氧化脫氨。單胺氧化酶與機體老化有關(guān)，被認為是衰老的標志，其主要存在于脊椎動物的各種器官，特別是分泌腺、腦、肝臟，在無脊椎動物、豆類的芽等植物中也存在催化單胺類物質(zhì)代謝，含量較低，具有重要的生理功能。

MAO催化單胺類底物脫氨生成相應(yīng)的醛，進一步氧化成酸，底物在360nm處有特征吸收峰，通過測定360nm處光吸收下降的速率，可計算MAO活性。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標儀、低溫離心機、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱中、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、震蕩儀、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）

1、 臨用前根據(jù)實驗用量取出部分提取液一、提取液二和試劑一置于4℃預(yù)冷30min。

2、 組織樣本：按照樣本質(zhì)量（g）：提取液一體積（mL）為1:5~10 的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴勻漿；1000g 4℃離心10min，取上清，將上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管，于10000g，4℃離心30min。棄上清，沉淀中加入1mL預(yù)冷的提取液二，振蕩混勻，于16000g，4℃離心40min，棄上清，加入1mL試劑一，振蕩混勻，置冰上待測。

3、 細菌或細胞樣本：收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清，按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液一體積（mL）為 500~1000:1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液一）加入提取液一，超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率200W，超聲3s，間隔7s，總時間3min），1000g，4℃離心10min，取上清，將上清液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的離心管，于10000g，4℃離心30min。棄上清，沉淀中加入1mL預(yù)冷的提取液二，振蕩混勻，于16000g，4℃離心40min，棄上清，沉淀中加入1mL試劑一，振蕩混勻，置冰上待測。

4、 血清（漿）或液體樣本：直接檢測。若溶液渾濁則離心后取上清進行測定。

二、測定步驟

1、紫外分光光度計/酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至360nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表（在微量石英比色皿/96孔UV板中依次加入下列試劑)：

三、MAO活力的計算

a．用微量石英比色皿測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白質(zhì)濃度計算

酶活定義：37℃，pH7.6條件下，每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol底物的酶量定義為一個酶活單位。

MAO活性（U/mg prot）= ΔA÷?÷d×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T=57.08×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：37℃，pH7.6條件下，每mg組織每分鐘消耗1nmol底物定義的酶量為一個酶活單位。

MAO活性（U /g 質(zhì)量）= ΔA÷?÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T=57.08×ΔA÷W

3、按細菌/細胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃，pH7.6條件下，每10⁴細菌/細胞每分鐘消耗1nmol底物的酶量定義為一個酶活單位。

MAO活性（U /10⁴ cell）= ΔA÷?÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)÷T=57.08×ΔA÷細胞數(shù)量

4、 按照樣本體積計算

酶活定義：37℃，pH7.6條件下，每mL血清或液體樣本每分鐘消耗1nmol 底物的酶量為一個酶活單位。

MAO 活性（U /mL）=ΔA÷?÷d ×V反總×10⁹÷V樣÷T= 57.08×ΔA

ε：底物摩爾消光系數(shù)：1460L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.0002L；V樣：加入樣本體積，0.02mL，V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，120min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

b．用96孔UV板測定的計算公式如下：

1、按樣本蛋白質(zhì)濃度計算

酶活定義：37℃，pH7.6條件下，每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol底物的酶量定義為一個酶活單位。

MAO活性（U /mg prot）= ΔA÷?÷d×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T= 95.13×ΔA÷Cpr

2、按樣本質(zhì)量計算

酶活定義：37℃，pH7.6條件下，每g組織每分鐘消耗1nmol底物的酶量定義為一個酶活單位。

MAO活性（U /g 質(zhì)量）= ΔA÷?÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×W)÷T= 95.13×ΔA÷W

3、按細菌/細胞數(shù)量計算

酶活定義：37℃，pH7.6條件下，每10⁴細菌/細胞每分鐘消耗1nmol底物的酶量定義為一個酶活單位。

MAO活性（U /10⁴ cell）= ΔA÷?÷d×V反總×10⁹÷(V樣÷V樣總×細胞數(shù)量)÷T= 95.13×ΔA÷細胞數(shù)量

4、 按照樣本體積計算

酶活定義：37℃，pH7.6條件下，每mL血清或液體樣本每分鐘消耗1nmol 底物的酶量為一個酶活單位。

MAO 活性（U/mL）=ΔA÷?÷d ×V反總×10⁹÷V樣÷T = 95.13×ΔA

ε：底物摩爾消光系數(shù)：1460L/mol/cm；d：96孔UV板光徑，0.6cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.0002L；V樣：加入樣本體積，0.02mL，V樣總：提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，120min；10⁹：單位換算系數(shù)，1mol=10⁹nmol。

參考文獻：

[1] Bolea I, Gella A, Unzeta M. Propargylamine-derived multitarget-directed ligands: fighting Alzheimer's disease with monoamine oxidase inhibitors[J]. J Neural Transm. 2013, 120(6):893-902.

[2] Schmidt K, Li Z, Schubert B, et al. Screening of entomopathogenic Deuteromycetes for activities on targets involved in degenerative diseases of the central nervous system[J]. Journal of Ethnopharmacology. 2003, 89(2-3):251-260.

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